Toksykologia

Test aberracji chromosomowych In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test OECD 473

Kod produktu: SSA-O473

Pakowanie: M020 20 Zestaw testowy Rapid Micronucleus MoA

Opis

In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Service Analytics (CRO z certyfikatem GLP), wytyczne testowe OECD473 dotyczące toksykologicznej oceny ryzyka in vitro chemikaliów, pestycydów, kosmetyków, mieszanek ziołowych.

Rapid Micronucleus MoA to gotowy do użycia zestaw do szybkiej identyfikacji aberracji chromosomowych. Komórki przygotowuje się zgodnie ze standardowymi protokołami według OECD TG 473, a szkiełka są kolejno traktowane serią roztworów dostarczonych z zestawem „Rapid Micronucleus MoA”, w tym specyficzną dla człowieka, bardzo czułą sondą centromerową i roztworem do barwienia kontrastowego zawierającego DAPI ( 4 ', 6-diamidyno-2-fenyloindol). Szkiełka są kolejno przemywane PBS i seriami etanolu po obróbce. Następnie do obszaru będącego przedmiotem zainteresowania dodaje się sondy centromerowe i szkiełko ogrzewa się w 80° C przez 3 minuty i przenosi do nawilżanej komory na 20 minut. Przed dodaniem roztworu mocującego następuje płukanie i 5-minutowy etap barwienia kontrastowego.

Używając obiektywu o powiększeniu 40x, będzie można łatwo zidentyfikować mikrojądra i ocenić, czy obecny jest centromer. Zautomatyzowany odczyt i archiwizację można uzyskać za pomocą systemów skanowania slajdów, np. Metafer.

Slajdy są zwykle gotowe do oceny w ciągu 1 godziny. Zastosowanie sond FISH pozwala bezpośrednio rozróżnić mikrojądra powstałe w wyniku utraty chromosomu (związki aneugeniczne) lub pęknięcia (związki klastogenne).

Technologia sondy FISH stosowana w testach aberracji chromosomowej (OECD 473), może być również stosowana w teście mikrojądrowym Micronucleus Test MNvit lub w analizie cytogenetycznej w badaniach lub dozymetrii fizycznej, tj. osoby narażone na promieniowanie medyczne lub naturalne.

Charakterystyka

1-godzinny test FISH - szybka i wiarygodna ocena genotoksyczności

Wysoka specyficzność - brak wyników fałszywie dodatnich z powodu RNA, mikrojąder o niskiej gęstości, osadów, zmian cytoplazmatycznych

Gotowy do użycia zestaw zawierający sondy pan-centromerowe, DAPI i odczynniki

Jednoczesne barwienie kontrastowe DAPI

Szybka i czytelna identyfikacja sposobu działania: Aneugens lub Clastogens

Barwienie centromerów metodą FISH jest zalecane w OECD TG487

Może być stosowany do chemikaliów, farmaceutyków, kosmetyków, próbek środowiskowych

Do wszystkich ludzkich komórek i pełnej krwi

Test Micronucleus Test MNvit do wykrywania aneugenów i klastogenów za pomocą metody FISH - Rapid Micronucleus MoA - OECD 487

Kod produktu: M020. Zawartość: 20 próbek / zestaw

Kod produktu: M100. Zawartość: 100 próbek / zestaw

Rapid Micronucleus MoA to gotowy do użycia zestaw do szybkiej identyfikacji aneugenów i klastogenów zgodnie z OECD 487. Komórki przygotowuje się zgodnie ze standardowymi protokołami według OECD TG 487, a szkiełka są kolejno traktowane serią roztworów dostarczonych w zestawie. „Rapid Micronucleus MoA”, włączając specyficzną dla człowieka, bardzo czułą sondę centromerową i roztwór do barwienia kontrastowego zawierający DAPI (4 ', 6-diamidyno-2-fenyloindol). Szkiełka są kolejno przemywane PBS i seriami etanolu po obróbce. Następnie do obszaru będącego przedmiotem zainteresowania dodaje się sondy centromerowe i szkiełko ogrzewa się w 80° C przez 3 minuty i przenosi do nawilżanej komory na 20 minut. Przed dodaniem roztworu mocującego następuje płukanie i 5-minutowy etap barwienia kontrastowego.

Używając obiektywu o powiększeniu 40x, będzie można łatwo zidentyfikować mikrojądra i ocenić, czy obecny jest centromer. Zautomatyzowany odczyt i archiwizację można uzyskać za pomocą systemów skanowania slajdów, np. Metafer.

Slajdy są zwykle gotowe do oceny w ciągu 1 godziny. Zastosowanie sond FISH pozwala bezpośrednio rozróżnić mikrojądra powstałe w wyniku utraty chromosomu (związki aneugeniczne) lub pęknięcia (związki klastogenne).

Technologia sondy FISH stosowana w zestawie Rapid Micronucleus MoA może być również stosowana w testach aberracji chromosomowych (OECD 473), analizie cytogenetycznej w badaniach lub w dozymetrii fizycznej, tj. osób narażonych na promieniowanie medyczne lub naturalne.

Częstość mikrojąder jest używana od wielu lat jako biomarker do pomiaru uszkodzeń chromosomów zgodnie z wytycznymi OECD TG487.

Charakterystyka

1-godzinny test FISH - szybka i wiarygodna ocena genotoksyczności

Wysoka specyficzność - brak wyników fałszywie dodatnich z powodu RNA, mikrojąder o niskiej gęstości, osadów, zmian cytoplazmatycznych

Gotowy do użycia zestaw zawierający sondy pan-centromerowe, DAPI i odczynniki

Jednoczesne barwienie kontrastowe DAPI

Szybka i czytelna identyfikacja sposobu działania: Aneugens lub Clastogens

Barwienie centromerów metodą FISH jest zalecane w OECD TG487

Może być stosowany do chemikaliów, farmaceutyków, kosmetyków, próbek środowiskowych

Do wszystkich ludzkich komórek i pełnej krwi

Dostępne także

Frakcja supernatantu S9 po mitochondriach z wątroby szczura indukowanej PB / ß-naftoflawonem, liofilizowana, 1 ml i 2 ml

Frakcja supernatantu S9 po mitochondriach z wątroby szczura indukowanej przez Aroclor 1254, liofilizowana, 1 ml i 2 ml *

* Należy pamiętać, że Aroclor 1254 jest sprzeczny z Konwencją sztokholmską w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych i został zakazany. Dlatego nie można zagwarantować dostępności S9 wywołanego przez Aroclor 1254 w przyszłości.

Referencje

  • Cuceu C, Colicchio B, Jeandidier E, Junker S, Plassa F, Shim G, Mika J, Frenzel M, Al Jawhari M., Hempel WM, O'Brien G, Lenain A, Morat L, Girinsky T, Dieterlen A, Polanska J, Badie C, Carde P, M'Kacher R. 2018. Independent mechanisms lead to genomic instability in Hodgkin lymphoma: Microsatellite or Chromosomal. Cancers (Basel). 10(7).pii:E233. Erratum in: 2019. Cancers (Basel). 11(6).pii:E757.
  • Zaguia N., Laplagne E., Colicchio B., Cariou O., Al Jawhari M., Heidingsfelder L., Hempel WM, Bel Hadj Jrad B, Jeandidier E, Dieterlen A, Carde P, Voisin P, M’Kacher R. 2020. A new tool for genotoxic risk assessment: Reevaluation of the cytokinesis block micronucleus assay using semi-automated scoring following telomere and centromere staining. Mutat Res Gen Tox En. 850-851:503143.

Pobierz katalog TEST MIKROJĄDROWY MoA

MicroAmes24 - test Ames'a na 24-dołkowej płytce agarowej

Kod produktu

D05-210

Pakowanie

Zestaw testowy dla 5 próbek, każda próbka w czterech powtórzeniach, 6 dawek, +/- S9, kontrole negatywne i pozytywne, kontrola sterylności

Opis

MicroAmes24 to gotowy do użycia zestaw zawierający szczepy, pożywki, ampicylinę, roztwór wzmacniający do uruchomienia testu Ames w zminiaturyzowanym formacie. Kontrole pozytywne i preparaty frakcji wątrobowej S9 ze szczura można wybrać oddzielnie. Bakterie poddaje się działaniu różnych i niskich stężeń próbki testowej, 6 mg / szczep, a także kontroli pozytywnej i negatywnej w pożywce zawierającej ograniczone ilości histydyny (S. typhimurium), aby podtrzymać w przybliżeniu dwa podziały komórek. Po ekspozycji hodowle w każdych warunkach (kontrola negatywna, próbki testowe i kontrole pozytywne) wlewano do 24-studzienkowych płytek. Ekspozycja jest wykonywana pod nieobecność i w obecności S9, który naśladuje działanie substancji chemicznej po metabolizowaniu w wątrobie szczura po mitochondrialnej frakcji S9. W ciągu trzech dni komórki, które przeszły powrót do prototrofii aminokwasów, będą rosnąć i tworzyć kolonie, których liczba zostanie porównana z tymi, które wyrosły w dołkach z rozpuszczalnikiem (negatywną) kontrolą. Zależny od dawki i znaczący wzrost liczby kolonii powracających po ekspozycji na próbkę badaną w stosunku do kontroli rozpuszczalnika wskazuje, że próbka jest mutagenna.

Dostępna jest usługa analityczna umożliwiająca wczesne wykrywanie leków z badanym związkiem 11 mg / szczep (+/- S9) z systemem testowym MicroAmes24, również w warunkach GLP i innych niż GLP, prosimy o kontakt pod adresem Ten adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript.

Charakterystyka

Produkty o kontrolowanej jakości: wszystkie produkty z zestawu i jako dodatek do zestawu

Certyfikat analizy w zestawie

Wystarczająca ilość materiału do obróbki szczepów indywidualnie, +/- S9

Wysyłane w temperaturze pokojowej z zewnętrznego magazynu w Niemczech

4 razy mniej badanego związku w porównaniu z testem Ames na 10 cm płytce agarowej

Mniej poświęconego czasu i jednoczesne opracowanie kilku powtórzeń

3R - 12-krotnie mniejsze zużycie frakcji wątrobowej ze szczura S9, mniej zwierząt testowych

Odpady - Znacznie mniej odpadów z tworzyw sztucznych, a tym samym zmniejszona ilość zanieczyszczonych odpadów w środowisku

Aby skompletować pełny zestaw testowy MicroAmes24, należy dodać:

Aroclor 1254 indukowana liofilizowana frakcja wątrobowa S9 ze szczura, 1 ml (PRS-AC01), 2 ml (PRS-AC02)

liofilizowana frakcja wątrobowa S9 ze szczura indukowana fenobarbitalem / β-naftoflawonem S9, 1 ml (PRS-PB01),

2 ml (PRS-PB02) 2-nitrofluoren (2-NF),

20 μg (PPC-NF00) 2-aminoantracen (2-AA),

100 μg, (PPC-AA01) 4-N-tlenek nitroochinoliny (4-NQO),

50 μg, zestaw kofaktora (PCO-0800) do przygotowania mieszaniny frakcji S9

Dostępne także

A10-210 Ames MPF 98/100 bez kontroli pozytywnych i S9

A10-210-S2-P Ames 98/100 z frakcją wątrobową S9 indukowaną PB / ß-naftoflawonem S9 *

Ames MPF 98/100 Aqua do próbek wody środowiskowej

Gotowe do użycia zestawy Ames MPF Penta 1 i Penta 2 oparte na 5 szczepach

Poszczególne odczynniki, takie jak frakcja wątrobowa S9 ze szczura

* zdecydowanie zalecane w porównaniu z S9 wywołanym przez Aroclor, Aroclor jest silnym zanieczyszczeniem środowiska i znajduje się na liście zakazanych chemikaliów UE.

Pobierz: ZMINIATURYZOWANY TEST MICROAMES24

XenoSkin H - modele skóry ludzkiej ex vivo w kształcie płatów i krążków

 

W ostatnich latach uzyskano możliwość zbadania w warunkach in vitro, czy substancje czynne zawarte w produktach farmaceutycznych, kosmetycznych oraz chemicznych mają zdolność przenikania przez "barierę skórną". Produkty lecznicze, kosmetyczne oraz chemiczne oddziałujące wyłącznie w głębiej zlokalizowanych warstwach skóry można obecnie badać za pomocą nowatorskich testów wykorzystujących modele skóry ludzkiej w warunkach ex vivo oraz nowoczesne metody analityczne bez koniecznosci prowadzenia rozległych i kosztownych badań klinicznych. Badania w warunkach in vitro z zastosowaniem produkty XenoSkin H stanowią także interesującą alternatywę w przypadku:

* optymalizacji składu produktu leczniczego w celu uzyskania wymaganego poziomu absorpcji leku poprzez skórę,

* badań interakcji preparatów chemicznych ze skórą w ramach oceny bezpieczeństwa,

* porównania produktów lub przygotowania leków do badań klinicznych,

* realizacji programów badań trwałości,

* opracowania produktów kosmetycznych.

XenoSkin H - ludzka skóra ex vivo

Dostępny jest szeroki wybór wycinków skóry ludzkiej i zwierzęcej ex vivo: skóra pełnej grubości wraz z tkanką tłuszczową lub bez tkanki tłuszczowej, wycinki skóry pośredniej grubości, wyizolowana warstwa rogowa oraz pojedyncze blaszki kopyta wołu. Modele skóry wysokiej jakości przygotowywane są z zachowaniem standardów GLP, w ciągu 1 godziny od zabiegu hirurgicznego. Skórę pobiera się od dawców, którzy udzielili na to świadomej zgody. W porównaniu z wycinkami martwej skóry modele ludzkiej skóry ex vivo posiadają kilka korzystniejszych cech, takich jak: ujednolicony, określony czas pomiędzy zabiegiem chirurgicznym i eksperymentami laboratoryjnymi, optymalna grubość wycinków skóry pobranych od osób w młodszym wieku oraz kontrloa dawców pod kątem obecności wirusów HCV i HIV.

W ofercia znajdują się również komory Franz'a dla potrzeb badania przenikania preparatów przez skórę.

Szczegółowy zakres produktów jest przedstawiony w Liście produktów (do pobrania poniżej).

Pobierz KATALOG XENOSKIN H

Pobierz BIULETYN TECHNICZNY XENOSKIN H

Pobierz LISTA PRODUKTÓW LUDZKIEJ I ZWIERZĘCEJ SKÓRY

CORROSITEX - system oceny przenikania substancji przez biomembranę

 

Corrositex jest testem in vitro, który określa chemiczną przenikalność substancji i pozwala określić klasyfikację pakowania zgodnie z wymogami dla Klasy 8.

Test alternatywny dla testów oceny działania substancji żrących na skórę królika.

Zasada testu
Podstawą testu jest odpowiednia biomembrana i chemiczny system kolorymetryczny, który zabarwia się podczas wystawienia go na działanie substancji potencjalnie żrących.

Korzyści
* Ograniczenie testów na zwierzętach
* Zmniejszenie kosztów badań
* Skrócenie czasu uzyskania wyniku (godziny zamiast tygodni)

Cechy
* Krótki czas uzyskania wyniku:
- dla substancji żrących: od 3 minut do 4 godzin
- dla substancji niewykazujących działania żrącego: 1 lub 4 godziny
* Kompletny zestaw odczynników pakowanych w sposób umożliwiający wykonanie testu
* Składniki testu:
każdy test składa się ze szklanej fiolki wypełnionej chemiczną substancją barwiącą, która przykrywana jest właściwą membraną stanowiącą biobarierę. Model taki jest zaprojektowany do imitacji efektów działania substancji żrących na skórę
* Wygodne pakowanie - 4 testy w pudełku

Zalety
* Zastąpienie testów na królikach
* Relatywnie niska cena
* Zmniejszenie kosztów całego oznaczenia i transportu
* Wymagana minimalna przestrzeń laboratoryjna
* Znacznie mniejsza dokumentacja


W 2009 firma Xenometrix została nagrodzona przez FROST & SULLIVAN za 4-paramterowy test oceny cytotoksyczności PAN I (LDHE-XTT-NR-SRB), który został uznany za najbardziej innowacyjny produkt roku 2009.

 

Pobierz NAGRODA FROST & SULLIVAN

 

Przedstawiamy przykładowe karty katalogowe testów wieloparametrowych.

 

Pobierz LDHE-XTT

Pobierz NR-SRB

Pobierz XTT-SRB

Pobierz LDHE-GLU-XTT-SRB

Pobierz LDHE-XTT-NR-SRB

1. Jakie cechy charakteryzują nasze oznaczenia cytotoksyczności?

• Małe zużycie związku.

• Szybkość i wydajność.

• Łatwe użycie i czytelny protokół.

• Rozsądna cena.

• Moliwość wykonania analizy bez skomplikowanego lub drogiego sprzętu komputerowego.

• Moliwość otrzymania jednoznacznego wyniku, bez wyrafinowanych metod.

• Oprogramowanie analityczne (dostarczane nieodpłatnie wraz z zestawem).

• Wsparcie producenta.

2. Co oferuje firma Xenometrix w sprzedaży testów do oceny cytotoksyczności?

• Zestaw „klasycznych” testów z szeroko akceptowalnymi metodami i publikacjami danych.

• Zestawy jedno- i wielo-parametrowe.

• Kompletne zestawy odczynników (w opcji płytki).

• Wysoka jakość - odczynniki sa certyfikowane.

• Zwalidowane protokoły.

• Bezpłatne wsparcie klienta przed i po sprzedaży.

• Mniejsze zużycie komórek w testach wieloparametrowych (komórki pierwotne!).

• Mniejsze zużycie zwiazku w testach wieloparametrowych (wcześniejsze wykrycie!).

• Udoskonalona czułość i specyficzność (łatwiej jest wychwycić toksyczność jesli badamy testem wieloparametrowym, nastepuje zredukowana moliwość otrzymania wyników fałszywych pozytywnych.

• Moliwość określenia działania mechanizmu toksyczności.

3. Jakie rozwiązania oferuje firma Xenometrix w sprzedaży testów do oceny cytotoksyczności w celu uniknięcia zakłóceń?

• Zastosowanie związków barwnych o alternatywnych długościach fali.

• Zastosowanie alternatywnych inhibitorów enzymów i barwników. Wiedza o niezgodnościach, np. zwiazki lizosomotroficzne (chlorchina), redox-active (kwas askorbinowy) związki generujące skażenia krzyżowe: FCS, pirogronian, czerwień fenolowa.

4. Jaka jest przewaga testów wieloparametrowych względem zmienności w obszarze jednego testu?

Techniczna optymalizacja użyta w wieloparametrowym zestawie firmy Xenometrix pozwala wyeliminować wewnętrzną wartość potencjalnych zmienności takich jak:

• Przejście ilościowe

• Czas umieszczenia na płytce (zmniejszenie stresu komórkowego)

• Została wyeliminowana różnica gęstości komórek pomiedzy poszczególnymi parametrami.

• Jest ujednolicony skład roztworów, ze względu na taki sam czas ich zastosowania i przygotowania. Rónice wartosci IC 50 pomiedzy oznaczeniami odzwierciedlają dokładniej różnice w odpowiedzi funkcji komórek wystawionych na działanie substancji toksycznej, ponieważ wszystkie inne zródła zmienności czynników zewnętrznych zostały wyeliminowane

5. Jak przedstawiaja sie koszty testów wieloparametrowych w porównaniu z jednoparametrowymi?

• Jest znacznie zredukowana ilość badanego zwiazku potrzebnego do badan w testach wieloparametrowych (może być bardzo drogi!)

• Mniejsze zużycie liczby komórek (drogie!) 

• Mniejsza cena jednostkowego oznaczenia w porównaniu z testami jednoparametrowymi

• Zmniejszony nakład pracy (może byc kosztowna).

6. Dlaczego powinnismy uywać testów firmy Xenometrix?

• Kontrolowane jakościowo odczynniki (certyfikaty, łatwość użycia, szczegółowe i dobrze przygotowane protokoły)

• Brak potrzeby specjalistycznego i drogiego sprzętu

• Bezposredni odczyt, bez specjalistycznego oprogramowania do oceny testów. Kalkulacja jest moliwa do wykonania w programie Excel lub w dodatku programowym typu lab-book i łatwym przeniesieniu do oprogramowania Xenometrix Celtox software

• Darmowe wsparcie przed i po sprzedaży zorientowanego i wyspecjalizowanego personelu

• Unikalność testów wieloparametrowych

7. Elastyczność: Jest moliwość dużej liczby kombinacji zestawów. Klient może stworzyć własną kombinację.

• XTT –NR?

• XTT –SRB?

• LDHe-XTT-SRB?

• NR-SRB-CVDE?

• LDHe-XTT-NR-CVDE?

8. Dlaczego powinno uywać się XTT zamiast MTT?

Tabela 1. Test kolorymetryczny do obliczania metabolizmu mitochondrialnego

 

Test                Parametry                                                Zasada 

XTT    Aktywność mitochondrialna         Sole tetrazolowe są rozpuszczalne do formazanu

MTT   Aktywność mitochondrialna         Sole tetrazolowe nierozpuszczalne w wodzie

                                                                są redukowane do formazanu                                              

1. Odczyt OD z XTT może być dokonany bezpośrednio po inkubacji. Podczas gdy, w teście MTT wymagana jest dłuższa inkubacja w celu rozpuszczenia wytraconych substancji przed odczytem. Po 15 minutach XTT ma wyższą czułość i wyższa dynamikę reakcji od MTT.

2. XTT – wynikiem reakcji jest barwnik soli tetrazolowej To eliminuje proces rozpuszczania (jak w tescie MTT), któremu często towarzyszy powstawanie babelków powietrza z SDS lub Tryton-X100. Użycie testów XTT oznacza mniejszą manipulację i w konsekwencji redukcje ryzyka błędu.

9. Porównanie XTT i MTT

XTT ma wyższą czułość (w 15 min.) i wyższą klasyfikację dynamiki (Wykres 1. i 2.)

Wykres 1. Przedstawia odczyt OD 15 min. Po solubilizacji w 37°C

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Wykres 2. Przedstawia odczyt OD 2 godz. po solubilizacji w 37°C

Warunki:

Komórki L929; 3 godz. inkubacji z XTT lub MTT odczyt z OD 480 (XTT) lub OD 540 (MTT)

Korekta dla OD 690, XTT odczytujemy bezposrednio po inkubacji.

MTT odczyt po solubilizacji z 10% Tryton X-100 w Izopropanolu / 0,1 M HCL i mieszamy, po 15 min. A i po 2 godz. w 37°C (B).

10. Przewaga zestawu LDH firmy Xenometrix

Test      Parametry                                      Zasada

LDH    Przepuszczalność membrany       LDH redukcja pirogronianu do mleczanu.

                                                                 Spadek NADH przez uwolnioną LDH

                                                                 mierzona z uszkodzonych komórek

Korzyści:

• Bez interferencji przez pirogronian, który jest czesto zawarty w pożywkach (Dulbecco’s, HAM F12, Iscove’s)!

• W testach konkurencyjnych mierzone jest powstawanie pirogronianu, którego powstawanie jest zakłócane w obecności pożywki. W doświadczeniu LDH mierzona jest przemiana NADH - NAD+. W procesie tym nadmiar pirogronianu jest zamieniany w mleczan. I wobec tego test nie jest czuły na pirogronian. Niektóre testy konkurencyjne wykorzystują odwrócenie przemiany, która może być zakłócona przez obecność pirogronianu.

• Wysoka czułość – mało wyników „fałszywych negatywnych”.

CZĘSTO ZADAWANE PYTANIA - FAQ - TESTY CYTOTOKSYCZNOŚCI

Wszystkie testy

1. W dołkach testowych powstają pęcherzyki powietrza. Dają one zafałszowane, odczyty gęstości optycznej OD.

Jest bardzo ważne, aby w całości usunąć bąbelki z dołków przed pomiarem gęstości optycznej OD. Można to osiągnąć poprzez chwilowy kontakt z płomieniem przesuwanym nad dołkami. W tym celu można użyć palnika Bunsena lub innego mini-palnika, ostrożnie, aby nie przegrzać dołków lub nie przypalić plastiku. Należy zachować ostrożność w przypadku obecności materiałów łatwopalnych lub płynnych, znajdujących się obszarze przestrzeni roboczej. W tym celu można także użyć suszarki do włosów.

2. Obserwowana jest duża różnica w powtarzalności gęstości optycznej OD między poszczególnymi dołkami w powtórzeniu.

Możliwe źródła różnicy w powtarzalności to: zbicie komórek i w rezultacie niejednolita liczba komórek w dołkach, częściowa utrata komórek w etapie wymywania, nierównomierne pipetowanie odczynnika (gubienie końcówki). Należy być szczególnie ostrożnym przy obecności bąbelków powietrza w dołkach. Usunąć je przy użyciu płomienia (uwaga!) lub suszarki do włosów.

3. Jaka koncentracja rozpuszczalnika powinna być użyta w tym teście?

To zależy również od linii komórkowej i długości czasu inkubacji. Jeśli badana substancja nie jest rozpuszczalna w wodzie zalecamy użyć DMSO. W większości systemów użycie DSMO w koncentracji do 2% jest bezpieczne. Jeśli potrzeba użyć wyższej koncentracji, należy wcześniej przetestować doświadczenie dla porównania na próbie ślepej. Etanol i metanol również mogą być użyte jako rozpuszczalniki. W większości systemów ich koncentracja do 2% jest bezpieczna.

Test na zużycie glukozy

4. Czy należy użyć tak mocnego kwasu jak: 12 M H2SO4 lub 37% HCl na koniec testu glukozy?

Tak, optymalny kolor otrzymujemy po użyciu mocnego kwasu.

5. W teście na glukozę obserwowana jest mała różnica między kontrolą a pozytywną kontrolą z komórkami. Co należy zrobić, aby zwiększyć tą różnicę?

Po pierwsze, należy sprawdzić rozcieńczenie próby, gdy używane są pożywki z wysoką zawartością glukozy. Doświadczenie mierzy koncentrację glukozy w przedziale 1-200 ml/ml.Można wydłużyć czas inkubacji komórek i/lub liczbę komórek na dołek. Konsumpcja dostępnej glukozy w 50%, może komórkom zabrać kilka dni. Jako wstępnego wskaźnika można użyć obserwacji koloru pożywki: kiedy przekształci się w kolor żółty to najprawdopodobniej została skonsumowana znacząca część glukozy.

6. Odbudowany roztwór glukozy, po przechowaniu przez kilka tygodni w temperaturze 4°C, zmienił kolor na lekko różowy. Czy można wciąż używać tego roztworu?

Roztworu tego wciąż można używać. Tak długo, dopóki nie wytworzy się osad. Wartości odczytów w gęstości optycznej OD będą minimalnie wyższe, ale różnice pomiaru OD powinny być zbliżone.

Test LDH

7. Czy można prowadzić kinetyczne pomiary gęstości optycznej OD w czasie rzeczywistym RT. 

Tak, odczyt kinetyczny może być prowadzony w czasie rzeczywistym (RT). Należy przedłużyć odczyt do 1 h.

8. Czytnik płytek nie pozwala na odczyt przy fali o długości 340 nm. Czy można użyć alternatywnej długości fali?

Nie. Należy użyć jedynie czytnika płytek umożliwiającego odczyt przy długości fali 340 nm.

9. Dlaczego jest powolny spadek przy pomiarze gęstości optycznej OD 340 nm. w roztworze kontrolnym?

Fetal Calf Serum użyte w roztworze są (przeważnie małym) źródłem aktywności LDH. Jeśli aktywność jest za wysoka, można spróbować zredukować ilość FCS w roztworze lub zmienić na inne źródło FCS.

10. Czy mogę przetrzymać supernatant i wykonać doświadczenie w późniejszym czasie?

      Tak. Można przetrzymać płytkę w 4°C przez kilka godzin, pod warunkiem zachowania sterylności i posiadania protein w pożywce (FCS, BSA). Nie zaleca się przechowywania supernatantu. Upewnij się, że supernatant i płytki przed doświadczeniem mają temperaturę pokojową.

11.  Jaki rodzaj substancji cytotoksycznej może być mierzony przez ten test?

      Test ten jest najbardziej odpowiedni do substancji wpływających na integralność błony komórkowej.

12.  Czy można bezpośrednio porównać otrzymany rezultat (jednostki na ml) z rezultatami otrzymanymi w innych oznaczeniach (testach) LDH?

      Nie, aktywność enzymatyczna mierzona w (jednostkach na objętość zależy od warunków oznaczenia (np. kompozycji buforu, temperatury, koncentracji substratu). Jeśli potrzeba ją porównać z wynikami innego testu, należy użyć tych samych substancji w obu testach i ocenić korelację między nimi.

13.  Pirogronian jest często zawarty pożywkach w takich jak: Dulbecco’s, lscover’s lub Ham –F12. W konkurencyjnych zestawach testowych może dojść do przemiany pirogronianu w oznaczeniu. Czy tak jest również w przypadku testów LDH firmy Xenometrix?

      W wersji testów firmy Xenometrix w doświadczeniu mierzone jest przekształcenie pirogronianu do mleczanu. Określona zawartość pirogronianu jest dodawana w reakcji do mieszaniny, w której jest ok. 50 razy większa koncentracja pirogronianu niż bierze udział w przemianie. W związku z tym obecność pirogronianu w pożywce nie ma istotnego znaczenia w równowadze reakcji lub jej poziomie.

Test PAC

14. Z roztworu zatrzymującego reakcję PAC IV zaczął wytrącać się ciemny osad. Czy można wciąż używać tego roztworu?

Można usunąć osad przez użycie wirówki przy konfiguracji: 3000 obr/min przez okres 5 minut. Roztwór zatrzymujący PAC IV będzie wciąż użyteczny.

Test XTT/MTT

15. Testy XTT i MTT wykrywają metabolizm mitochondrialny. Który test należy wybrać i dlaczego?

XTT ma przewagę w dwóch punktach nad MTT: 1) jest on czulszy, a 2) rezultatem reakcji jest rozpuszczany barwnik soli formazanu. To eliminuje finałowy krok rozpuszczania, co oznacza mniejsza manipulację i w rezultacie redukcję ryzyka powstania błędu.

MTT jest tańszym testem.

Innym czynnikiem, może być dostępność filtra do odczytu płytek.

XTT wymaga 480 lub 450 nm oraz filtr referencyjny 690 nm. MTT wymaga 540 nm i filtr referencyjny 690 nm.

Jeśli dostęp do filtra w twoim laboratorium jest ograniczony, to zalecamy użycie testu XTT.

XTT - MTT

Zastosowania

Test kolorymetryczny do obliczenia metabolizmu mitochondrialnego i aktywności łańcucha oddechowego komórek w odpowiedzi na związki farmaceutyczne, chemiczne i środowiskowe oraz substancje odżywcze.

ZASADA

Sole tetrazolowe XTT i MTT można stosować do obliczania aktywności metabolicznej żywych komórek. Sole tetrazolowe są redukowane do formazanu dzięki działaniu mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu aktywnego tylko w komórkach o nienaruszonym metabolizmie i łańcuchu oddechowym. Ilość formazanu zostaje obliczona fotometrycznie i koreluje z liczbą żywych komórek.

W przeciwieństwie do MTT produkt formazanu pochodzący z XTT jest rozpuszczalny w wodzie. Dlatego w teście z zastosowaniem XTT etap rozpuszczania, który umożliwia otrzymanie wyników średnio po około 3 godzinach (w zależności od długości inkubacji), nie jest potrzeby. Test z MTT wymaga dodatkowej całonocnej inkubacji.

OCENA PARAMETRÓW BIOLOGICZNYCH

IC50 (stężenie hamujące 50%)

Cytotoksyczność metaboliczna

Aktywność łańcucha oddechowego

Pobierz KATALOG MTT-XTT

 

Kliknij na link aby zobaczyć publikacje dotyczące testu Ames MPF

http://www.xenometrix.ch/index.php?id=11

 

Test AMES w formie mikropłytkowej

* Test całkowicie spełniający wymogi wytycznych OECD 471

* Mikropłytkowy test Ames MPF Fluctuation Assay jest dostarczany jako kompletny zestaw ze szczepami i pożywkami gotowymi do użycia

* Mikropłytkowy test Ames MPF Fluctuation Assay może być stosowany do wykrywania mutagennej aktywności substancji chemicznych, kosmetyków, farmaceutyków, dodatków do żywności, wody, powietrza, gleby i osadów

* Dostarczane organizmy Salmonella typhimurium i Escherichia coli podlegają ścisłej kontroli jakości (genotyp i fenotyp)

* Co najmniej 3 razy mniejsze zużycie odczynników niż w tradycyjnym teście Ames’a

* Mniejszy nakład pracy przy wykonaniu testu i 6 razy mniej materiałów niż w tradycyjnym teście Ames’a

* Mniejsze zużycie frakcji S9 niż w tradycyjnym teście Ames’a

* Mikropłytkowy format nadający się do automatycznego odczytu

* Dostępne oprogramowanie do opracowania wyników - dostęp do ściągnięcia po zalogowaniu

* Dostępne wsparcie ze strony producenta

Zasada testu

Mutacje punktowe zostały wprowadzone do operonu biosyntezy histydyny (Salmonella typhimurium) lub tryptofanu (Escherichia coli), co sprawiło, że takie bakterie nie syntetyzują odpowiedniego aminokwasu. Te mutacje sprawiają, że organizmy his- lub trp- nie będą wzrastać, jeżeli na podłożu nie ma histydyny lub tryptofanu. Jeżeli zadziała czynnik mutagenny, substytucja zasad lub zmiana ramki odczytu w obrębie genu może spowodować rewersję mutacji. Takie bakterie z rewersją mutacji mogą rosnąć na podłożach odpowiednio bez histydyny lub tryptofanu.

Potencjał mutagenny związku chemicznego jest oceniany poprzez ekspozycję takich organizmów wymagających podania odpowiedniego aminokwasu na różne stężenia związku chemicznego, a następnie wybranie zdarzenia, gdy nastąpiła rewersja. Do takiego wyboru stosowane są podłoża nie zawierające odpowiednich aminokwasów, ponieważ na takich podłożach przeżywają i wzrastają tylko te komórki, w których nastąpiła rewersja mutacji.

Szczepy zawarte w tym zestawie to szczepy Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 i TA1537 oraz szczepy E.coli wp2 [pKM101] i wp2 uvrA. Szczepy TA100, TA1535 i E.coli są przeznaczone do wykrywania mutacji polegających na substytucji zasad, a szczepy TA98 i TA1537 do wykrywania mutacji ramki odczytu. Szczepy S. typhimurium mają pary zasad GC, natomiast szczepy parę zasad AT w głównym miejscu rewersji i wykrywają pewne mutageny utleniające, czynniki sieciujące i hydrazyny.

Szczepy zawarte w tym zestawie spełniają wymagania wytycznych OECD 471 do badania związków chemicznych.

 

Pobierz KATALOG

Pobierz WYTYCZNE OECD 471 (J. ANGIELSKI)

Pobierz ZGODNOŚĆ MIKROPŁYTKOWEGO TESTU AMES MPF Z WYTYCZNYMI OECD 471

Pobierz POSTER AMES MPF 98/100

Pobierz POSTER AMES MPF 98/100/1535/1537

Pobierz CZĘSTO ZADAWANE PYTANIA

TIGRET Sp. z o.o.

ul. Warszawska 27
02-495 Warszawa

+48 22 8670528/9

 

Rzetelna firna

© Tigret 2021
Wykonanie: Solmedia.pl