Często zadawane pytania

CZĘSTO ZADAWANE PYTANIA - FAQ - TESTY CYTOTOKSYCZNOŚCI

Wszystkie testy

1. W dołkach testowych powstają pęcherzyki powietrza. Dają one zafałszowane, odczyty gęstości optycznej OD.

Jest bardzo ważne, aby w całości usunąć bąbelki z dołków przed pomiarem gęstości optycznej OD. Można to osiągnąć poprzez chwilowy kontakt z płomieniem przesuwanym nad dołkami. W tym celu można użyć palnika Bunsena lub innego mini-palnika, ostrożnie, aby nie przegrzać dołków lub nie przypalić plastiku. Należy zachować ostrożność w przypadku obecności materiałów łatwopalnych lub płynnych, znajdujących się obszarze przestrzeni roboczej. W tym celu można także użyć suszarki do włosów.

2. Obserwowana jest duża różnica w powtarzalności gęstości optycznej OD między poszczególnymi dołkami w powtórzeniu.

Możliwe źródła różnicy w powtarzalności to: zbicie komórek i w rezultacie niejednolita liczba komórek w dołkach, częściowa utrata komórek w etapie wymywania, nierównomierne pipetowanie odczynnika (gubienie końcówki). Należy być szczególnie ostrożnym przy obecności bąbelków powietrza w dołkach. Usunąć je przy użyciu płomienia (uwaga!) lub suszarki do włosów.

3. Jaka koncentracja rozpuszczalnika powinna być użyta w tym teście?

To zależy również od linii komórkowej i długości czasu inkubacji. Jeśli badana substancja nie jest rozpuszczalna w wodzie zalecamy użyć DMSO. W większości systemów użycie DSMO w koncentracji do 2% jest bezpieczne. Jeśli potrzeba użyć wyższej koncentracji, należy wcześniej przetestować doświadczenie dla porównania na próbie ślepej. Etanol i metanol również mogą być użyte jako rozpuszczalniki. W większości systemów ich koncentracja do 2% jest bezpieczna.

Test na zużycie glukozy

4. Czy należy użyć tak mocnego kwasu jak: 12 M H2SO4 lub 37% HCl na koniec testu glukozy?

Tak, optymalny kolor otrzymujemy po użyciu mocnego kwasu.

5. W teście na glukozę obserwowana jest mała różnica między kontrolą a pozytywną kontrolą z komórkami. Co należy zrobić, aby zwiększyć tą różnicę?

Po pierwsze, należy sprawdzić rozcieńczenie próby, gdy używane są pożywki z wysoką zawartością glukozy. Doświadczenie mierzy koncentrację glukozy w przedziale 1-200 ml/ml.Można wydłużyć czas inkubacji komórek i/lub liczbę komórek na dołek. Konsumpcja dostępnej glukozy w 50%, może komórkom zabrać kilka dni. Jako wstępnego wskaźnika można użyć obserwacji koloru pożywki: kiedy przekształci się w kolor żółty to najprawdopodobniej została skonsumowana znacząca część glukozy.

6. Odbudowany roztwór glukozy, po przechowaniu przez kilka tygodni w temperaturze 4°C, zmienił kolor na lekko różowy. Czy można wciąż używać tego roztworu?

Roztworu tego wciąż można używać. Tak długo, dopóki nie wytworzy się osad. Wartości odczytów w gęstości optycznej OD będą minimalnie wyższe, ale różnice pomiaru OD powinny być zbliżone.

Test LDH

7. Czy można prowadzić kinetyczne pomiary gęstości optycznej OD w czasie rzeczywistym RT. 

Tak, odczyt kinetyczny może być prowadzony w czasie rzeczywistym (RT). Należy przedłużyć odczyt do 1 h.

8. Czytnik płytek nie pozwala na odczyt przy fali o długości 340 nm. Czy można użyć alternatywnej długości fali?

Nie. Należy użyć jedynie czytnika płytek umożliwiającego odczyt przy długości fali 340 nm.

9. Dlaczego jest powolny spadek przy pomiarze gęstości optycznej OD 340 nm. w roztworze kontrolnym?

Fetal Calf Serum użyte w roztworze są (przeważnie małym) źródłem aktywności LDH. Jeśli aktywność jest za wysoka, można spróbować zredukować ilość FCS w roztworze lub zmienić na inne źródło FCS.

10. Czy mogę przetrzymać supernatant i wykonać doświadczenie w późniejszym czasie?

      Tak. Można przetrzymać płytkę w 4°C przez kilka godzin, pod warunkiem zachowania sterylności i posiadania protein w pożywce (FCS, BSA). Nie zaleca się przechowywania supernatantu. Upewnij się, że supernatant i płytki przed doświadczeniem mają temperaturę pokojową.

11.  Jaki rodzaj substancji cytotoksycznej może być mierzony przez ten test?

      Test ten jest najbardziej odpowiedni do substancji wpływających na integralność błony komórkowej.

12.  Czy można bezpośrednio porównać otrzymany rezultat (jednostki na ml) z rezultatami otrzymanymi w innych oznaczeniach (testach) LDH?

      Nie, aktywność enzymatyczna mierzona w (jednostkach na objętość zależy od warunków oznaczenia (np. kompozycji buforu, temperatury, koncentracji substratu). Jeśli potrzeba ją porównać z wynikami innego testu, należy użyć tych samych substancji w obu testach i ocenić korelację między nimi.

13.  Pirogronian jest często zawarty pożywkach w takich jak: Dulbecco’s, lscover’s lub Ham –F12. W konkurencyjnych zestawach testowych może dojść do przemiany pirogronianu w oznaczeniu. Czy tak jest również w przypadku testów LDH firmy Xenometrix?

      W wersji testów firmy Xenometrix w doświadczeniu mierzone jest przekształcenie pirogronianu do mleczanu. Określona zawartość pirogronianu jest dodawana w reakcji do mieszaniny, w której jest ok. 50 razy większa koncentracja pirogronianu niż bierze udział w przemianie. W związku z tym obecność pirogronianu w pożywce nie ma istotnego znaczenia w równowadze reakcji lub jej poziomie.

Test PAC

14. Z roztworu zatrzymującego reakcję PAC IV zaczął wytrącać się ciemny osad. Czy można wciąż używać tego roztworu?

Można usunąć osad przez użycie wirówki przy konfiguracji: 3000 obr/min przez okres 5 minut. Roztwór zatrzymujący PAC IV będzie wciąż użyteczny.

Test XTT/MTT

15. Testy XTT i MTT wykrywają metabolizm mitochondrialny. Który test należy wybrać i dlaczego?

XTT ma przewagę w dwóch punktach nad MTT: 1) jest on czulszy, a 2) rezultatem reakcji jest rozpuszczany barwnik soli formazanu. To eliminuje finałowy krok rozpuszczania, co oznacza mniejsza manipulację i w rezultacie redukcję ryzyka powstania błędu.

MTT jest tańszym testem.

Innym czynnikiem, może być dostępność filtra do odczytu płytek.

XTT wymaga 480 lub 450 nm oraz filtr referencyjny 690 nm. MTT wymaga 540 nm i filtr referencyjny 690 nm.

Jeśli dostęp do filtra w twoim laboratorium jest ograniczony, to zalecamy użycie testu XTT.

TIGRET Sp. z o.o.

ul. Warszawska 27
02-495 Warszawa

+48 22 8670528/9

 

Rzetelna firna

© Tigret 2021
Wykonanie: Solmedia.pl